双光子显微镜双光子吸收/激发技术的原理：在强光激发下，分子同时吸收两个光子，从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。两个光子可以是相同波长的，也可以是不同波长的，但必须是同时吸收（两个光子到达被激发分子的时间间隔小于1飞秒）。可以这样理解，先吸收一个光子的能量跃迁到一个虚拟的中间态，然后再吸收一个光子的能量跃迁到激发态。
双光子显微镜相对于共聚焦等其他显微镜的优点：
双光子显微镜光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对活体细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；
双光子显微镜穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；研究表明，共聚焦荧光成像的成像深度一般在50微米左右，而双光子显微镜的成像深度可达1000微米；
双光子显微镜高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内。
